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產(chǎn)品中心PCR&q-PCR核酸定量測(cè)定AN54L029PikoGreen dsDNA quantitation reagent
產(chǎn)品簡(jiǎn)介
PikoGreen dsDNA quantitation reagent（優(yōu)于PicoGreen）是一種極為靈敏的雙鏈DNA熒光染料，于雙鏈DNA的定量。測(cè)定DNA濃度在cDNA文庫(kù)構(gòu)建、DNA亞克隆、PCR產(chǎn)物估測(cè)等領(lǐng)域中非常重要，另外疫苗等生物制品中殘留微量DNA的檢測(cè)因關(guān)系人身健康，顯得尤為重要。
產(chǎn)品分類(lèi)
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| 品牌 | 其他品牌 | 貨號(hào) | AN54L029 |
|---|---|---|---|
| 規(guī)格 | 1ML | 供貨周期 | 現(xiàn)貨 |
| 主要用途 | 在存在ssDNA、RNA和單體核苷酸的條件下,可以選擇性地檢測(cè)低至25 pg/m | 應(yīng)用領(lǐng)域 | 化工,生物產(chǎn)業(yè) |
PikoGreen dsDNA quantitation reagent是一種極為靈敏的雙鏈DNA熒光染料，僅與DNA雙鏈結(jié)合后才發(fā)出熒光，且所產(chǎn)生的熒光與DNA濃度呈正比，在存在ssDNA、RNA和單體核苷酸的條件下，可以選擇性地檢測(cè)低至25 pg/mL的dsDNA。與傳統(tǒng)DNA定量方法相比，具有靈敏度高，特異性強(qiáng)，耐受性好，線(xiàn)性范圍寬及方便操作等優(yōu)點(diǎn)，適用于cDNA文庫(kù)構(gòu)建、DNA亞克隆、PCR產(chǎn)物等領(lǐng)域的DNA濃度的精確測(cè)定。相比傳統(tǒng)的方法，Pikogreen dsDNA Quantitation Reagent定量具有以下優(yōu)勢(shì)：
靈敏：數(shù)量級(jí)較UV吸光讀數(shù)更敏感，可節(jié)省樣品。
特異性強(qiáng)：只結(jié)合dsDNA，特異性強(qiáng)，不受樣品常規(guī)污染影響。傳統(tǒng)紫外吸光法容易受樣品中存在的單鏈DNA，蛋白，RNA等影響。
耐受性好：耐受較高濃度的鹽、尿素、乙醇、氯仿、去垢劑、蛋白或瓊脂糖，可以直接定量PCR擴(kuò)增產(chǎn)物而無(wú)需從反應(yīng)混合物中純化DNA。
線(xiàn)性范圍寬：PikoGreen dsDNA染料測(cè)定DNA濃度，在100pg/ml-100ng/ml范圍內(nèi)呈良好線(xiàn)性；熒光計(jì)兼容。
容易使用：在樣品中加入染料，等待5~6 min染色，然后讀數(shù)即可，且適用于96和384孔板。與大多數(shù)基于熒光的酶標(biāo)儀和可適用于各種DNA樣品分析、PCR的分析、芯片樣品、DNA損傷分析、酶活性分析、基因組DNA定量以及復(fù)雜混合物中dsDNA的檢測(cè)和病毒DNA定量等多種領(lǐng)域。
該分析在四個(gè)數(shù)量級(jí)范圍內(nèi)呈線(xiàn)性，且?guī)缀鯚o(wú)序列依賴(lài)性，可以精確地測(cè)量多個(gè)來(lái)源的DNA，包括基因組DNA、病毒DNA、小量提取DNA或PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。該方法因其穩(wěn)定性、靈敏性，已經(jīng)錄入《中國(guó)藥典》。
訂購(gòu)信息
| 產(chǎn)品名稱(chēng) | 貨號(hào) | 規(guī)格 |
| PikoGreen dsDNA quantitation reagent(優(yōu)于PicoGreen) | AN54L029 | 1 mL |
運(yùn)輸與保存
藍(lán)冰運(yùn)輸。-20℃避光保存，有效期24個(gè)月。
使用方法
1. PikoGreen工作液的配制
使用前將PikoGreen dsDNA定量試劑回溫至室溫；PikoGreen以100 µL 200×的濃縮液形式保存于無(wú)水DMSO中的（共10管）。實(shí)驗(yàn)當(dāng)天，根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求用1×TE按1:200 的比例稀釋適量定量試劑濃縮液。例如要準(zhǔn)備足夠的操作溶液以2 mL檢測(cè)體系測(cè)定20個(gè)樣品，可向19.9 mL 1×TE 中加入100 µL PikoGreen dsDNA 定量試劑。工作液見(jiàn)光易降解，盡量在配好后幾小時(shí)內(nèi)使用。
2. 配制標(biāo)準(zhǔn)品DNA溶液
（1）用1 X TE溶液溶解dsDNA制備1 μg/mL dsDNA 。根據(jù)在1 cm 光程長(zhǎng)度的比色杯中A260 nm時(shí)的吸光度確定DNA 濃度；相應(yīng)于1 μg/mLdsDNA 溶液A260=0.02。標(biāo)準(zhǔn)液常用小牛胸腺DNA制備，PikoGreen 試劑測(cè)定法在通常污染核酸*劑的幾種復(fù)合物存在的條件下仍能保持線(xiàn)性良好，但是，為了得到有效的對(duì)照處理，被用來(lái)做標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的dsDNA 溶液要用和實(shí)驗(yàn)樣品相同的方式來(lái)處理，并且應(yīng)該包含相同的可能存在的污染物。
（2）制備從0.5 ng/mL 到500ng/mL（見(jiàn)表1）單重復(fù)8 個(gè)點(diǎn)的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。配制一系列的標(biāo)準(zhǔn)DNA 溶液，然后與等體積的PikoGreen 工作液混和，放入1 x 1cm 比色杯中?；旌舷嗤w積的1 x TE 和PikoGreen 操作溶液作為空白對(duì)照,避光于室溫下放置2~5 min。
表1: 用1 x 1cm 比色杯時(shí)DNA 標(biāo)準(zhǔn)濃度配制參考
| 標(biāo)準(zhǔn)DNA 溶液濃度（ng/mL） | 標(biāo)準(zhǔn)DNA 溶液體積（mL） | PikoGreen 工作液體積（mL） | 標(biāo)準(zhǔn)DNA 終濃度(ng/mL) |
| 1000 | 1 | 1 | 500 |
| 200 | 1 | 1 | 100 |
| 50 | 1 | 1 | 25 |
| 20 | 1 | 1 | 10 |
| 5 | 1 | 1 | 2.5 |
| 2 | 1 | 1 | 1 |
| 1 | 1 | 1 | 0.5 |
| 0 | 1 | 1 | 空白 |
（3） 當(dāng)用微量檢測(cè)皿適配器時(shí)，PikoGreen 測(cè)定也可在較低的測(cè)定體積（50 μL 到200 μL）內(nèi)完成。產(chǎn)生從1 ng/mL 到100 ng/mL（見(jiàn)表2）的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，配制一系列的標(biāo)準(zhǔn)DNA 溶液，然后與等體積的PikoGreen 工作液混和，將至少50 μL 溶液轉(zhuǎn)移到微量檢測(cè)皿中。確信不要在樣品中引入氣泡，輕輕地彈微量檢測(cè)皿的外部經(jīng)?？梢则?qū)散氣泡。避光于室溫下放置2-5 min。
表2：用微量檢測(cè)皿DNA 標(biāo)準(zhǔn)濃配制參考
| 標(biāo)準(zhǔn)DNA 溶液濃度（ng/mL） | 標(biāo)準(zhǔn)DNA 溶液體積（mL） | PikoGreen 工作液體積（mL） | 標(biāo)準(zhǔn)DNA 終濃度(ng/mL) |
| 200 | 30 | 30 | 100 |
| 50 | 30 | 30 | 25 |
| 20 | 30 | 30 | 10 |
| 5 | 30 | 30 | 2.5 |
| 2 | 30 | 30 | 1 |
| 0 | 30 | 30 | 空白 |
（4） 孵育后用合適的熒光計(jì)測(cè)量樣品熒光值。Ex/Em=480 nm/520 nm，為了減少光漂白，應(yīng)保持所有樣品的檢測(cè)時(shí)間一致。用熒光值最大的樣品校正儀器。
（5）用檢測(cè)數(shù)據(jù)與DNA標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度做回歸分析，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。
3. 樣品分析
（1）用1 x TE 稀釋待測(cè)DNA 樣品至需要的體積（1x1 cm 比色杯需1.0 mL，微量檢測(cè)皿需25~100 μL）。對(duì)樣品高度稀釋可以確保任何污染物都被最大限度地沖淡。然而，也要避免取樣體積太小而無(wú)法精確吸取的情況。
（2）在每個(gè)樣品中加入等體積PikoGreen 工作液，混合好，將混合物移入合適的比色杯，避光于室溫下放置2~5 min。
（3）檢測(cè)、讀取熒光值，換算樣品中dsDNA濃度?？梢詫?duì)樣品進(jìn)行不同的稀釋處理重復(fù)測(cè)定以確保結(jié)果的準(zhǔn)確性。
注意事項(xiàng)
本產(chǎn)品僅限于科學(xué)實(shí)驗(yàn)研究使用，不得用于臨床診斷、治療等領(lǐng)域。
PikoGreen定量試劑含有DMSO，PikoGreen 是結(jié)合dsDNA，操作時(shí)采取適當(dāng)防護(hù)，戴手套小心操作。
盡管常見(jiàn)污染物不會(huì)影響PikoGreen 檢測(cè)dsDNA濃度（見(jiàn)表3），但是當(dāng)樣品中dsDNA濃度太低，RNA, ssDNA濃度超過(guò)dsDNA 10倍以上時(shí)，RNA, ssDNA等污染還是會(huì)對(duì)檢測(cè)結(jié)果產(chǎn)生較大干擾，在此種情況下，RNA 酶可以消除RNA干擾, RNA 酶A、酶T1 、核酸酶S1 結(jié)合能除去ssDNA干擾，從而保證樣品熒光值是由dsDNA 產(chǎn)生。
表3：Pikogreen定量耐受的污染物列表
| 物質(zhì)名稱(chēng) | 最大耐受濃度 | 信號(hào)變化百分比 |
| Salts | ||
| Ammonium acetate | 50 mM | 3% decrease |
| Sodium acetate | 30 mM | 3% increase |
| Sodium chloride | 200 mM | 30% decrease |
| Zinc chloride | 5 mM | 8% decrease |
| Magnesium chloride | 50 mM | 33% decrease |
| Urea | 2 M | 9% increase |
| Organic Solvents | ||
| Phenol | 0.1% | 13% increase |
| Ethanol | 10% | 12% increase |
| Chloroform | 2% | 14% increase |
| Detergents | ||
| Sodium dodecyl sulfate | 0.01% | 1% decrease |
| Triton X-100 | 0.1% | 7% increase |
| Proteins | ||
| Bovine serum albumin | 2% | 16% decrease |
| IgG | 0.1% | 19% increase |
| Other Compounds | ||
| Polyethylene glycol | 2% | 8% increase |
| Agarose | 0.1% | 4% increase |
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