分析ELISA實驗中非特異性顯色原因

更新時間：2017-05-18

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　　影響ELISA中非特異性顯色的原因很多，如試劑盒特異性、檢驗標本中含酶標記物的干擾物，操作過程中的問題。本文就這一原因作一簡要分析，以便可以通過以上措施把非特異顯色降至zui低限度，從而提高檢測的特異性，并得到更準確、可靠的實驗結果。

　　酶聯免疫吸附試驗（ELISA）自1971年自問世以來，以其敏感性高，特異性強，操作簡便、安全，而廣泛應用于臨床診斷，開創了免疫學診斷的新紀元。但同其它免疫診斷方法一樣酶免試劑在它的研究、生產及使用中常常會碰到非特異性問題，本文就在實驗過程中產生的一些原因及如何采取一些措施，消除非特異性顯色作一分析。

　　一、試劑盒特異性因素

　　1、固相載體的選擇。ELISA中常用的固相載體有微量滴定板、小珠和小試管三種，以微量滴定板zui為常見[1]。它具有良好的吸附性能，孔底透明度高，空白值低，各板之間、同一板各孔之間性能相近。聚苯乙烯ELISA板由于原料的不同和制作工藝的差別，各產品的質量差異很大。因此，在選擇試劑盒同時要對其使用的微孔板型號進行認證，評估。

　　2、包被物的純度。在酶聯免疫測定尤其是間接ELISA中，試劑的特異性取決于使用抗原的純度。目前由于技術條件的限制，包被用抗原或抗體的純度不可能達到100%，所以有些非特異性顯色不可避免，只能盡可能提高純度，提高特異性。目前使用的包被抗原一般為合成多肽抗原。

　　3、包被抗體的效價。具有高親和力和高特異性的包被抗體，是決定試劑特異性的重要方面。

　　4、封閉。是ELISA中重要的一步，目的是封閉固相載體表面尚未被所占據的空隙[2]，減少后續步驟中非特異性蛋白的干擾。

　　二、檢驗標本中含有酶標記物的干擾物

　　1、內源性干擾物：類風濕因子（RF）、黃疸等，類風濕因子是可作用于多種動物以及人IgGFc段的自身抗體，多數為IgM類，能充當抗原成分與固相及酶標抗體反應，從而呈現非特異性顯色。

　　黃疸血標本中常含有內源性過氧化物酶，如用辣根過氧化物酶為標記物，就有可能產生非特異性顯色。

　　2、外源性干擾物，常常因樣品采集、貯存、處理不當造成如樣品溶血，被細菌污染，標本凝集不全等。溶血標本，紅細胞溶解破裂，釋放出血紅素形成，而血紅素中的鐵卟啉是過氧化物酶的類似物，以HRP為標記的ELISA測定中，溶血標本可能會增加非特異性顯色。如有細菌污染，菌體中可能含有內源性HRP（辣根過氧化酶）[2]，有國內報道酶免HBsAg試劑檢測溶血標本時可造成假陽性[3]。如在冰箱中保存過久，其中的IgG可發生聚合，在間接法ELISA中可使本底加深[2]。因此，血標本在采集處理時應小心，在冰箱中保存不易過久。

　　標本凝集不全時，血清中會殘留部分纖維蛋白原，也易造成假陽性。