在該研究中，研究者構(gòu)建了多個(gè)BER相關(guān)基因的敲除細(xì)胞株，結(jié)合體外脫氨實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)TALEDs并非直接在雙鏈DNA上進(jìn)行A-to-G編輯，而是依賴DddA誘導(dǎo)C-to-U的脫氨反應(yīng)，觸發(fā)線粒體堿基切除修復(fù)(BER)過(guò)程。在該過(guò)程中，TALED中的DddA首先介導(dǎo)了C-to-U的脫氨，體內(nèi)的尿嘧啶糖苷酶會(huì)進(jìn)一步切除所產(chǎn)生的尿嘧啶(U)，從而形成堿基缺乏(AP)位點(diǎn)，含有AP位點(diǎn)的DNA單鏈被APE1催化切割或自發(fā)斷裂，產(chǎn)生DNA單鏈斷裂(SSB)。SSB被核酸外切酶hMGME1進(jìn)一步加工形成單鏈DNA(ssDNA)，TALED中的TadA8e以ssDNA為底物介導(dǎo)A-to-I的脫氨反應(yīng)，并在隨后的修復(fù)過(guò)程中完成A-to-G的編輯。
TALED工作機(jī)制示意圖
進(jìn)一步，研究者利用BER開(kāi)發(fā)了一系列增強(qiáng)型TALEDs (eTALED6s)，顯著提高了TALEDs在靶向位點(diǎn)處的編輯效率。并且通過(guò)對(duì)腺嘌呤脫氨酶TadA8e進(jìn)行工程化改造，使得TALEDs在轉(zhuǎn)錄組水平上的脫靶突變顯著降低，同時(shí)還縮小了編輯窗口，減少了旁觀者效應(yīng)，顯著提高了編輯產(chǎn)物純度。研究者還使用esTALED6和工程化的esTALED6R在線粒體基因組中模擬了與Leigh綜合征和MELAS相關(guān)的致病突變m.A13514G，通過(guò)測(cè)量氧耗率(OCR)，證實(shí)eTALEDs成功誘導(dǎo)了預(yù)期的線粒體功能異常。
這項(xiàng)研究不僅補(bǔ)充了TALED分子機(jī)制研究的空白，還在分子機(jī)制研究的基礎(chǔ)上進(jìn)一步構(gòu)建了一系列精準(zhǔn)、高效、低脫靶的新型線粒體腺嘌呤堿基編輯工具，使其在線粒體疾病模型構(gòu)建、遺傳修復(fù)和相關(guān)基礎(chǔ)研究中具有廣泛的應(yīng)用前景。
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更新時(shí)間：2025-07-10
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