細(xì)胞增殖及細(xì)胞活力檢測方法

更新時間：2022-05-25

點(diǎn)擊次數(shù)：7761

一、細(xì)胞增殖與細(xì)胞活性

　　細(xì)胞增殖是活細(xì)胞的重要?理功能之?，細(xì)胞增殖與細(xì)胞活性檢測所用的方法相近，但實(shí)驗(yàn)?zāi)康牟煌＜?xì)胞增殖是通過細(xì)胞增殖的物質(zhì)基礎(chǔ)判斷細(xì)胞的數(shù)量變化，例如細(xì)胞計(jì)數(shù)法，反應(yīng)的就是細(xì)胞真實(shí)的數(shù)量。而細(xì)胞活性檢測，則是通過檢測細(xì)胞受到藥物或其他措施處理后，標(biāo)志物產(chǎn)量或濃度的變化，進(jìn)而判斷藥物或處理措施的作用，細(xì)胞活性檢測所得結(jié)論，往往反映了實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的目的。

　　細(xì)胞增殖檢測，因檢測標(biāo)志物的不同，目前大致分為四類：DNA合成檢測、代謝活性檢測、細(xì)胞增殖相關(guān)抗原檢測和ATP濃度檢測。細(xì)胞活性檢測通常包括細(xì)胞膜對核酸染料的通透性、代謝活性、膜電位等的檢測，確定細(xì)胞的代謝活?或細(xì)胞代謝產(chǎn)物，通過檢測細(xì)胞的氧化還原活性反映細(xì)胞增殖能?。

二、常見細(xì)胞增殖檢測方法

1.DNA合成檢測——BrdU / EdU檢測法

　　細(xì)胞在增殖過程中，DNA的倍增，是顯著的變化之一，通過檢測DNA量的變化，可判斷細(xì)胞數(shù)量的變化。通過檢測DNA進(jìn)行細(xì)胞增殖檢測方法，除了同位素標(biāo)記DNA外，常用的就是：BrdU / EdU檢測法。BrdU(5-溴脫氧尿嘧啶核苷)是胸腺嘧啶（T）的衍生物，可代替胸腺嘧啶在摻入S期的DNA合成，然后利用抗Brdu的單克隆抗體，ICC染色，顯示增殖細(xì)胞，如果與其它細(xì)胞標(biāo)記物進(jìn)行雙染，則可判斷增殖細(xì)胞的種類，增殖速度，對研究細(xì)胞動力學(xué)有重要意義。

　　Edu檢測法是BrdU的替代方法，也是目前更廣泛適用的方法，RrdU需抗體在破開DNA雙聯(lián)后與抗原分子集合后才能顯示，這個處理過程對細(xì)胞有損傷，而EdU同樣可以代替胸腺嘧啶（T）滲入DNA，但其分子大小只有BrdU的1/500，可以直接在DNA雙鏈形態(tài)下與染料分子結(jié)合用于檢測，無需抗體結(jié)合反應(yīng)，實(shí)驗(yàn)過程簡單，對細(xì)胞損傷小，是新一代基于DNA檢測時報增殖的試劑。

2.代謝活性物質(zhì)檢測——MTT、CCK8

　　MTT與CCK8兩種方法都是利用檢測細(xì)胞內(nèi)線粒體中琥珀酸脫氫酶濃度，進(jìn)而反映細(xì)胞增殖活性。MTT(3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴鹽)被琥珀酸脫氫酶還原為水不溶性的藍(lán)紫色結(jié)晶甲瓚（formazan）并堆積在細(xì)胞內(nèi)，然后以DMSO溶解甲瓚，通過檢測甲瓚的吸光度來間接反映存活細(xì)胞的相對數(shù)量。

　　CCK8中的主要物質(zhì)WST-8是一種類似于MTT的化合物，在電子耦合試劑存在的情況下，可以被線粒體內(nèi)的琥珀酸脫氫酶還原生成橙黃色的、水溶性formazan。細(xì)胞增殖越多越快，則顏色越深；反之，則顏色越淺。CCK-8的原理跟MTT其實(shí)是相同的，不同之處在于CCK-8法生成的formazan是水溶性的，不需要再吸出培養(yǎng)液加入有機(jī)溶劑溶解這個步驟，對細(xì)胞毒性小，可進(jìn)行活細(xì)胞動態(tài)測定，試劑穩(wěn)定即開即用，重復(fù)性好于MTT。

3.細(xì)胞增殖相關(guān)抗原檢測

　　Ki-67,PCNA都是細(xì)胞增殖因子，在細(xì)胞異常增殖中均有顯著的表達(dá)差異，是研究腫瘤細(xì)胞增殖的重要核抗原。Ki-67,PCNA均與細(xì)胞周期密切相關(guān)，通過免疫反應(yīng)檢測Ki-67,PCNA可反應(yīng)腫瘤細(xì)胞增殖情況。

4.ATP濃度檢測

　　細(xì)胞內(nèi)的ATP是細(xì)胞能量的重要來源，其含量與細(xì)胞周期和細(xì)胞狀態(tài)關(guān)系密切，死細(xì)胞或?yàn)l臨死亡的細(xì)胞幾乎不含ATP。在細(xì)胞中測得的ATP濃度與細(xì)胞數(shù)之間存在嚴(yán)格的線性關(guān)系。利用熒光素酶Luciferase及其底物熒光素Luciferin的ATP檢測以生物發(fā)光為基礎(chǔ)，能夠?yàn)槟峁┓浅ｌ`敏的結(jié)果。如果有ATP存在熒光素酶就會發(fā)光，而且其發(fā)光強(qiáng)度與ATP濃度成正比，這種方法非常適用于高通量細(xì)胞增殖檢測和篩選。Promega公司開發(fā)的CellTiter-Glo Luminescent 實(shí)現(xiàn)了"加樣－混合－測量"的簡單快速檢測模式，CellTiter-Glo試劑和細(xì)胞培養(yǎng)中的常用培養(yǎng)基兼容，如RPMI 1640, MEM, DMEM, 和Ham's F12，且不受酚紅和有機(jī)溶劑的影響，可用于高通量自動化篩選（HTS）。

5.羥基熒光素二醋酸鹽琥珀酰亞胺脂（CFSE）檢測法

　　羥基熒光素二醋酸鹽琥珀酰亞胺脂（CFSE）是一種可穿透細(xì)胞膜的熒光染料，具有與細(xì)胞內(nèi)基質(zhì)特異性結(jié)合的琥珀酰亞胺脂基團(tuán)和具有非酶促水解作用的羥基熒光素二醋酸鹽基團(tuán)，CFSE進(jìn)入細(xì)胞后可以不可逆地與細(xì)胞內(nèi)的氨基結(jié)合偶聯(lián)到細(xì)胞蛋白質(zhì)上。當(dāng)細(xì)胞分裂時，CFSE標(biāo)記熒光可平均分配至兩個子代細(xì)胞中，子代細(xì)胞熒光強(qiáng)度是親代細(xì)胞的一半，在一個增殖的細(xì)胞群中，各連續(xù)代細(xì)胞的熒光強(qiáng)度遞減，利用流式細(xì)胞儀在488nm激發(fā)光和熒光檢測通道可對其進(jìn)行分析。

三、細(xì)胞增殖/活性檢測方法比較

常見細(xì)胞增殖/活性檢測方法比較見下表（含李記生物產(chǎn)品、貨號）

檢測試劑	試劑盒原理	適用樣本	檢測設(shè)備	生產(chǎn)廠家
EdU/BrdU檢測試劑盒（李記新品：AC11L251）	檢測新新合成DNA，在細(xì)胞增殖過程，檢測加入到新合成DNA的胸苷類似物（BrdU, EdU）	細(xì)胞樣本或組織樣本	流式細(xì)胞術(shù) 或成像分析或酶標(biāo)儀	李記生物 GeneCopoeia
CFDA, SE 細(xì)胞增殖示蹤熒光探針（李記貨號：AC11L101）	通過檢測親代和子代細(xì)胞中染料CFSE濃度進(jìn)行細(xì)胞增殖次數(shù)分析	細(xì)胞樣本	流式細(xì)胞術(shù)	李記生物 Thermofisher
Cell Counting Kit（CCK-8 試劑盒）（李記貨號：AC11L054）	通過檢測細(xì)胞內(nèi)琥珀酸脫氫酶的還原能力，反應(yīng)細(xì)胞活性。檢測細(xì)胞還原能力熒光信號與代謝中的活細(xì)胞數(shù)量成正比	細(xì)胞樣本，HTS	酶標(biāo)儀	李記生物日本東仁化學(xué)
AlamarBlue細(xì)胞活性檢測	染料分子在細(xì)胞內(nèi)被還原后釋放到胞外，檢測熒光，提示細(xì)胞代謝變化	細(xì)胞樣本，HTS	酶標(biāo)儀	李記生物 Thermofisher
CTG CellTiter-Glo （李記研發(fā)中）	ATP使熒光素酶發(fā)射熒光	細(xì)胞樣本,HTS	酶標(biāo)儀	李記生物 Promega