細胞凍存和復蘇經驗總結

更新時間：2017-11-22

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細胞凍存過程對保持細胞狀態影響巨大，李記生物結合多年實踐，總結出如下實用的細胞凍存流程。 “慢凍快融” 是細胞凍存及復蘇的基本原則，這對zui大限度的保存細胞活力至關重要。目前細胞凍存多用甘油或二甲基亞砜（DMSO）作為保護劑，這兩種物質能提高細胞膜對水的通透性；細胞凍存和復蘇時，減少細胞內冰晶產生是關鍵。緩慢冷凍可使細胞內的水分滲出細胞外，減少細胞內冰晶的形成，從而減少冰晶對細胞的物理損傷。復蘇細胞采用快速融化的方法可以保證細胞外結晶在很短的時間內融化，避免由于緩慢融化使水分滲入細胞內形成胞內再結晶對細胞造成損傷。

細胞凍存操作流程：

1、細胞凍存前12~24h，換新鮮培養基，使細胞一直處于對數生長期。

2、待細胞長至80%匯合時胰酶消化，用新鮮培養基吹打后制成細胞懸液，1000rpm離心10min。懸浮細胞則直接離心。

3、棄上清，加入凍存液重懸細胞沉淀，調整細胞濃度為3×106~1×107cells/mL。將細胞懸液分至凍存管內，每管1~1.5mL，擰緊蓋子。在管壁上做好標記，標明細胞名稱、凍存日期等。（細胞凍存液配方可為胎牛血清：培養基：DMSO=4：6：1或胎牛血清：培養基：DMSO=1：9：1或胎牛血清：DMSO=9：1，可根據各實驗室實際條件調整）

4、按下列順序依次降溫：室溫→4℃ 20min →-20℃ 30min →-80℃放一晚→液氮保存。也可使用程序降溫盒更為方便，細胞凍存管放入程序降溫盒內可直接放入-80℃放一晚，再轉至液氮罐內。注意程序降溫盒內異丙醇的量必須高于zui低刻度線；凍存5次后異丙醇需要跟換一次，以免影響凍存效果。

5、細胞凍存后應取出一管復蘇，檢測細胞的存活率。理論上細胞可在液氮內長期保存，為穩妥起見可在細胞凍存半年后復蘇培養，觀察細胞生長情況，再繼續凍存。

細胞復蘇操作流程：

1、將培養基在37℃水浴鍋預熱；準備一個15mL無菌的離心管，加入8mL預熱培養基。

2、將凍存細胞從液氮罐中取出，快速放入37℃水浴鍋中復溫（可準備一潔凈的燒杯，裝滿37℃的水，細胞凍存管取出后迅速放入燒杯內，再逐步轉移到水浴鍋中）。輕輕晃動凍存管，使細胞能在1~2min內*解凍，使細胞能盡快通過zui易受損的溫度段（-5~0℃）。注意凍存管管口不能沒入水中，避免引起污染。

3、用75%酒精擦拭凍存管后再置于超凈臺內，將管內細胞轉移至準備好的離心管內，輕輕吹打液體，使細胞均勻分散，降低DMSO濃度，吹打時避免產生氣泡。用新鮮培養基洗管壁2次，均轉移至離心管內。

4、800rpm離心5min，棄上清，加入新鮮的培養基，吹打制成細胞懸液。

5、將細胞懸液轉移至T25細胞瓶內，補加適量的培養基，輕輕晃動細胞瓶使細胞分布均勻，放入溫箱內培養。

6、第二天觀察細胞貼壁生長情況，換新鮮培養基以去除死細胞。繼續培養，待細胞長至80~90%匯合時正常傳代。一般剛復蘇的細胞需經過2~3次傳代，細胞活力恢復后才能進行后續的實驗。

對DMSO不敏感的細胞在復蘇時也可不離心，減少操作步驟，也可降低污染的幾率。將解凍的細胞懸液直接轉移至T25細胞瓶內，補加新鮮培養基，放入溫箱內培養。但培養12~20h后必須換新鮮的培養基，移除死細胞。

注意事項：
1.  取細胞的過程中注意帶好防凍手套，護目鏡。此項尤為重要，細胞凍存管可能漏入液氮，解凍時凍存管中的氣溫急劇上升，可導致爆炸。
2.  凍存液的問題：凍存液的配置已是常識，在這里不作詳述，但二甲基亞砜（DMSO）對細胞不是*無毒副作用，在常溫下，二甲基亞砜對細胞的毒副作較大，因此，必須在1-2min內使凍存液*融化。如果復蘇溫度太慢，會造成細胞的損傷，二甲基亞砜（DMSO）選擇進口產品。
3.  離心前須加入少量培養液。細胞解凍后二甲基亞砜濃度較高，注意加入少量培養液可稀釋其濃度，以減少對細胞的損傷。
4.  離心問題：目前主要有兩種見解。一種是解凍后的細胞懸液直接吹打均勻后分裝到培養瓶中進行培養，第二天換液。因為離心的目的是兩個，去除 DMSO，去除死細胞，這個是標準流程，但對一般人來說，把握不好離心轉速和時間，轉的不夠活細胞沉底的少，細胞就全被扔掉了，轉過了活細胞會受壓過大，死亡。此外在操作過程中容易污染，所以不推薦。另一種說法為細胞懸液中含有二甲基亞砜（DMSO），DMSO對細胞有一定的毒副作用，所以須將離心后的液體前倒凈，且一定倒干凈。我在試驗中按照常規的離心分裝的方法進行復蘇，結果無有異常。
5.  細胞貼壁少的問題：教科書中說明凍存細胞解凍時1ml細胞液要加10ml－15m培養液，而在我的試驗中的經驗總結為培養基越少細胞越容易貼附。
6.  復蘇細胞分裝的問題：試驗中我的經驗總結為復蘇1管細胞一般可分裝到1-2只培養瓶中，分裝過多，細胞濃度過低，不利于細胞的貼壁。
7.  加培養基的量放入問題：這個量的多少的把握主要涉及到的問題是DMSO的濃度，從如果你加培養基的太少，那么DMSO的濃度就會比較大，就會影響細胞生長，從以前的資料來看，DMSO的濃度在小于0.5%的時候對一般細胞沒有什么影響，還有一個說法是1％。所以如果你的凍存液的濃度是 10％DMSO的話那么加10ml以上的培養基就恰好稀釋到了無害濃度。

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